Получение инсулина с помощью рекомбинантных микроорганизмов

Содержание

1. 1. Инсулин: история открытия и медицинское значение3
2. 2. Генетическая инженерия: инструменты создания продуцентов5
3. 3. Биосинтез и очистка рекомбинантного инсулина7
4. 4. Перспективы и ограничения биотехнологического производства10
5. Список литературы12

1. Инсулин: история открытия и медицинское значение

Инсулин, это пептидный гормон, который вырабатывают β-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы. Его главная задача, снижать концентрацию глюкозы в крови: он заставляет клетки мышечной и жировой ткани поглощать сахар, а в печени тормозит глюконеогенез. Если этого гормона не хватает (абсолютно или относительно), развивается сахарный диабет. Это хроническое заболевание, которое поражает сосуды, почки, сетчатку глаза и периферические нервы. По данным Международной диабетической федерации, на начало 2020-х годов в мире насчитывалось более 500 миллионов больных диабетом, и для значительной части из них ежедневные инъекции инсулина остаются единственным способом поддерживать жизнеспособность.

История инсулина как лекарства началась в 1921 году в Торонто. Фредерик Бантинг и его ассистент Чарльз Бест выделили из поджелудочной железы собаки экстракт, который снижал уровень сахара у животных с экспериментальным диабетом. В январе 1922 года этот экстракт впервые ввели 14-летнему пациенту Леонарду Томпсону, находившемуся в коме. Эффект оказался драматическим: мальчик пришёл в сознание, и его состояние стабилизировалось. За это открытие Бантинг и его научный руководитель Джон Маклеод получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1923 году. Примечательно, что они отказались патентовать метод производства и передали права Университету Торонто, чтобы препарат был доступен как можно большему числу больных.

В последующие десятилетия инсулин получали исключительно из поджелудочных желёз крупного рогатого скота и свиней. К середине XX века технология была отработана: железы собирали на бойнях, измельчали, экстрагировали кислотой и проводили многоступенчатую очистку. Однако у этого подхода были принципиальные ограничения. Во-первых, для удовлетворения мирового спроса требовалось огромное количество сырья.

Расчёты показывали: чтобы обеспечить одного больного диабетом на год, нужно около двух тонн поджелудочных желёз животных. Во-вторых, животный инсулин отличается от человеческого по аминокислотной последовательности (бычий, на три аминокислоты, свиной, на одну). Из-за этих отличий препарат был иммуногенным. У многих пациентов через несколько месяцев или лет терапии вырабатывались антитела к чужеродному белку, что снижало эффективность лечения и вызывало аллергические реакции.

Была и третья проблема, этического и экономического характера. Число больных диабетом росло, особенно после Второй мировой войны, и сырья стало не хватать. Цены на инсулин поднимались, а в ряде развивающихся стран препарат был вообще недоступен. Кроме того, существовал риск контаминации животного белка примесями других гормонов (например, глюкагона), что требовало сложных методов очистки. Хроматографическая очистка, внедрённая в 1960-х годах, решила проблему примесей, но не убрала иммуногенность, заложенную в самой структуре животного инсулина.

Выходом стало получение точной копии человеческого гормона. В 1978 году исследовательская группа под руководством Артура Риггса и Кэйити Итакуры в Калифорнии впервые синтезировала инсулин человека в клетках кишечной палочки Escherichia coli. Для этого ген, кодирующий А- и В-цепи инсулина, встроили в бактериальную плазмиду. Уже через год компания Genentech объявила о промышленном производстве, а в 1982 году препарат «Хумулин» одобрило Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США. Так началась эра рекомбинантного инсулина: по своей структуре он полностью идентичен гормону, который вырабатывают β-клетки человека, и потому лишён недостатков животного сырья. Этот технологический прорыв сделал инсулин массово доступным препаратом, а его производство перешло из разряда экстрактивных технологий в область современной биотехнологии.

2. Генетическая инженерия: инструменты создания продуцентов

Начало любого генно-инженерного проекта, это работа с молекулярными ножницами и нитками. Рестриктазы, ферменты, узнающие строго определённые последовательности ДНК, разрезают двойную спираль. Именно они позволяют вырезать фрагмент, кодирующий проинсулин, из геномной ДНК человека. Следом вступает ДНК-лигаза, которая сшивает этот фрагмент с молекулой-носителем, образуя рекомбинантную конструкцию. Для получения гена инсулина in vitro часто применяют обратную транскриптазу: этот фермент синтезирует ДНК-копию (кДНК) со зрелой матричной РНК. Так удаётся получить последовательность без интронов, пригодную для экспрессии в бактериях.

Плазмида, как правило, служит основным вектором для доставки гена в клетку. Это небольшая кольцевая молекула ДНК, способная к автономной репликации. Ключевой элемент конструкции, селективный маркер, чаще всего ген устойчивости к антибиотику (например, ампициллину или канамицину). Он позволяет отобрать те клетки, которые действительно получили плазмиду: без него трансформанты просто погибли бы на среде с антибиотиком. Не менее важен промотор, участок ДНК, к которому присоединяется РНК-полимераза. Для контроля экспрессии в E. coli часто используют индуцибельный промотор lac, который «включается» добавлением в среду изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Это даёт возможность сначала нарастить биомассу, а затем запустить синтез целевого белка, избегая токсического эффекта от его накопления на ранних стадиях роста.

Введение готовой плазмиды в бактериальную клетку, задача нетривиальная. Классический метод, трансформация: клетки обрабатывают хлоридом кальция, делая мембрану проницаемой для ДНК. Этот способ эффективен, но требует предварительной подготовки компетентных клеток.

Альтернатива, электропорация, когда кратковременный электрический импульс высокой напряжённости создаёт в мембране поры, через которые ДНК проходит внутрь. Метод быстрее, но требует дорогого оборудования. Существует и третий путь, конъюгация, при которой плазмида передаётся от одной бактерии к другой через прямой контакт. Однако в промышленном производстве инсулина конъюгация используется редко: она менее предсказуема и хуже поддаётся масштабированию.

Выбор организма-хозяина определяет всю дальнейшую технологию. Escherichia coli остаётся самой изученной и удобной бактерией: её геном секвенирован, для неё разработаны тысячи векторов. Но у неё есть существенный недостаток. Бактерия не способна к посттрансляционным модификациям эукариотических белков, а инсулин требует корректного формирования трёх дисульфидных связей. Поэтому в E. coli ген проинсулина экспрессируют в виде гибридного белка, например, с β-галактозидазой, которая защищает продукт от протеолиза. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae лишены этой проблемы: они секретируют правильно свернувшийся проинсулин в культуральную среду, что упрощает его последующий процессинг. Именно поэтому дрожжевая система считается более выгодной для получения зрелого гормона, несмотря на более медленный рост и сложность генетических манипуляций. Фармакопейные статьи подтверждают: оба продуцента допустимы, но требования к чистоте конечного продукта одинаково строги.

3. Биосинтез и очистка рекомбинантного инсулина

Сразу после попадания рекомбинантной плазмиды внутрь клетки-хозяина начинается самый протяжённый и трудоёмкий этап производства. Экспрессия гена инсулина в бактериях напрямую, в виде нативного полипептида, оказывается неэффективной: малый пептид быстро расщепляется внутриклеточными протеазами. Поэтому ген встраивают в состав химерного гена, кодирующего гибридный белок. Классический подход, описанный в работах Гилберта и его коллег ещё в конце 1970-х, предполагает слияние цепи инсулина с β-галактозидазой. Крупный белок-носитель стабилизирует молекулу, защищает её от деградации и позволяет накапливать продукт в виде телец включения, что упрощает первичное выделение.

Ферментацию проводят в биореакторах объёмом от сотен до тысяч литров. Для Escherichia coli, основного продуцента, оптимизируют состав среды, температуру и аэрацию. Ключевой момент здесь, индукция промотора. В промышленных штаммах чаще всего используют lac- или T7-промоторы, которые активируются добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы. Момент индукции критичен: если добавить индуктор слишком рано, клетки не успеют набрать биомассу; если поздно, культура вступит в стационарную фазу и синтез белка резко упадёт. Обычно индукцию запускают при оптической плотности культуры 0,6-1,0, после чего процесс продолжают ещё 3-6 часов. Выход гибридного белка может достигать 20-40% от общего клеточного белка, но на этом этапе он неактивен и находится в денатурированном состоянии.

Дальше начинается выделение целевого продукта. Биомассу отделяют центрифугированием, затем клетки разрушают. Для E. coli применяют гомогенизацию под высоким давлением или обработку лизоцимом с последующим осмотическим шоком. Тельца включения, плотные агрегаты денатурированного белка, отмывают от фрагментов клеточной стенки и растворимых примесей. Гибридный белок растворяют в буфере с 6-8 М мочевиной или

гуанидингидрохлоридом. Затем проводят расщепление химическим или ферментативным способом. Например, если инсулин соединён с носителем через остаток метионина, используют бромциан, который разрезает пептидную связь именно после этого остатка. При ферментативном расщеплении применяют трипсин, но он требует точного контроля времени реакции, иначе деградирует сам инсулин.

Полученный препроинсулин или раздельные цепи A и B нуждаются в ренатурации, то есть сворачивании в правильную пространственную структуру. Это самый капризный этап. Для образования трёх дисульфидных мостиков (два межцепочных и один внутрицепочечный) требуется окислительная среда. На практике белок медленно диализуют против буфера с понижающейся концентрацией мочевины в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона. Выход правильно свернутого продукта редко превышает 30-40%; остальное, агрегаты и misfolded-формы. Если синтезировали отдельные цепи, их смешивают в эквимолярном соотношении и проводят окислительное сочетание. При использовании дрожжей Saccharomyces cerevisiae процессинг идёт иначе: клетки секретируют проинсулин в среду, где сигнальный пептид отрезается естественным образом, и остаётся лишь провести ферментативное удаление C-пептида.

Очистку проводят многоступенчато. Первой, как правило, идёт ионообменная хроматография на DEAE- или Q-сефарозе, которая отделяет инсулин от большинства примесей по заряду. Затем следует гель-фильтрация на сефадексе G-50, разделяющая молекулы по размеру и убирающая димеры и агрегаты. Завершающий аккорд, аффинная хроматография с иммобилизованными антителами или металлохелатная хроматография. Суммарный выход после всех стадий составляет около 15-25% от исходного количества гибридного белка, но чистота достигает 99,5% и выше.

Контроль качества регламентирован фармакопейными статьями. Основной метод, обращённо-фазовая ВЭЖХ (HPLC), позволяющая количественно определить содержание инсулина и его деградационных примесей.

Дополнительно используют масс-спектрометрию для подтверждения точной молекулярной массы, обычно 5808 Да для человеческого инсулина. Биологическую активность оценивают in vivo на кроликах по снижению уровня глюкозы в крови или in vitro по связыванию с рецептором. Обязателен тест на бактериальные эндотоксины и стерильность. Только после прохождения всего набора испытаний препарат допускается к выпуску, поскольку даже незначительное отклонение в структуре может изменить его фармакологические свойства.

4. Перспективы и ограничения биотехнологического производства

Рекомбинантная технология изменила рынок инсулина радикально. Сейчас почти весь гормон для клинической практики получают микробиологическим синтезом. Главное преимущество такого подхода, чистота продукта, и именно она определяет безопасность терапии. Препараты, которые производят Escherichia coli или дрожжи, не содержат примесей животного белка. Поэтому они практически не вызывают иммунных реакций, бывших настоящим бичом лечения в прошлом веке. Масштабируемость процесса позволяет наращивать объёмы производства по мере роста заболеваемости. С ресурсами поджелудочных желёз скота такой манёвр невозможен в принципе.

Экономика производства тоже изменилась, и заметно. На заре генной инженерии цена за единицу инсулина была высокой, но отработка технологий ферментации и очистки привела к её многократному снижению. Современные фармакопейные требования (например, те, что изложены в нормативных документах Министерства здравоохранения РФ) жёстко регламентируют качество. При этом они не делают процесс настолько дорогим, чтобы он стал недоступен. В итоге базовые формы человеческого инсулина дошли до основной массы пациентов. В программах государственных закупок это особенно заметно.

Однако идеализировать ситуацию не стоит. Создание и поддержание промышленной линии требует колоссальных капитальных вложений. Биореакторы, системы стерильной асептики, аналитическое оборудование для контроля каждой партии, всё это стоит миллионы долларов. Сложность очистки остаётся узким местом. Даже незначительная примесь белков клетки-хозяина или фрагментов ДНК способна вызвать нежелательный ответ у человека. Поэтому хроматографические стадии требуют высокой квалификации персонала и строгого соблюдения протоколов. Есть и риск контаминации: бактериофаги или посторонние

микроорганизмы могут нарушить процесс. Это вынуждает внедрять дорогостоящие системы валидации и непрерывного мониторинга.

Будущее связывают с поиском более эффективных продуцентов. Дрожжи Pichia pastoris рассматриваются как серьёзная альтернатива E. coli. Они способны к правильному фолдингу белков и секреции инсулина прямо в культуральную среду, что заметно упрощает выделение целевого продукта. Синтетическая биология позволяет конструировать штаммы с оптимизированными метаболическими путями. Экспрессия гена инсулина там регулируется точными индуцибельными промоторами, а протеолиз сведён к минимуму за счёт делеций соответствующих пептидаз. Отдельное направление, разработка аналогов инсулина. Учёные меняют аминокислотную последовательность гормона, чтобы изменить его фармакокинетику. Создаются сверхбыстрые формы для купирования гипергликемии после еды, а также длительные базальные аналоги, поддерживающие стабильную концентрацию в течение суток. Эти молекулы получают всё теми же рекомбинантными методами. Они уже сейчас позволяют точнее имитировать физиологическую секрецию инсулина и снижают риск гипогликемий. Так биотехнология решает старые проблемы и одновременно создаёт новые терапевтические возможности, которые для животного инсулина были просто недостижимы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Генно-инженерные препараты инсулина человека — https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/1/1-7/1-7-1/genno-inzhenernye-preparaty-insulina-cheloveka/

2. Синтез инсулина путем генной инженерии и применение его в ... — https://journals.csu.ru/index.php/vcsu_eh/article/view/1770

3. КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ... — https://iairas.ru/mag/2004/full2/Art11.pdf

4. Биотехнология получения гормональных ... — https://elib.gsu.by/bitstream/123456789/8909/1/%D0%9A%D0%BE%D0%BD%D1%86%D0%B5%D0%B2%D0%B0%D1%8F_%D0%9B%D0%B5%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F_14-%D0%91%D0%B8%D0%BE%D1%82%D0%B5%D1%85%D0%BD%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D1%83%D1%87%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F_%D0%B3%D0%BE%D1%80%D0%BC%D0%BE%D0%BD%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D1%8B%D1%85_%D0%BE%D0%BD%D0%BE%D0%B2.pdf

5. Раздел "Генная инженерия" — https://www.biotechnolog.ru/ge/ge1_1.htm

6. Синтез инсулина путем генной инженерии и применение ... — https://journals.csu.ru/index.php/vcsu_eh/article/view/1770

7. Инсулин. Как ГМО спасает миллионы жизней - Хабр — https://habr.com/ru/companies/sberbank/articles/821289/

8. ФС_Инсулин_растворимый__человеческий_генно-инженерный — https://static-0.minzdrav.gov.ru/system/attachments/attaches/000/044/084/original/%D0%A4%D0%A1_%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%83%D0%BB%D0%B8%D0%BD_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B2%D0%BE%D1%80%D0%B8%D0%BC%D1%8B%D0%B9__%D1%87%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%B2%D0%B5%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D0%BE-%D0%B8%D0%BD%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%80%D0%BD%D1%8B%D0%B9__08.04.19.docx?1554903254