Биореакторы для культивирования клеток животных

Содержание

1. 1. Биореакторы: роль в биотехнологии3
2. 2. Конструкции биореакторов для клеток5
3. 3. Контроль параметров и режимы работы8
4. 4. Масштабирование и перспективы развития11
5. Список литературы14

1. Биореакторы: роль в биотехнологии

Биореактор в самом широком смысле, это устройство, создающее контролируемую среду для жизнедеятельности клеток. Для клеток животных он принципиально отличается от классического ферментера, используемого в микробиологии. Микроорганизмы выдерживают высокие сдвиговые нагрузки и агрессивное перемешивание. Клетки млекопитающих лишены плотной клеточной стенки, они крупнее и гораздо чувствительнее к механическим повреждениям. Поэтому конструкция аппарата, скорость вращения мешалки и способ подачи воздуха должны быть щадящими, а сама среда сложнее: требует строгого контроля pH, температуры и газового состава, но при этом не допускает образования пузырьков, способных убить клетку при лопании.

История этих устройств началась задолго до появления термина «биотехнология». Первые попытки культивировать ткани вне организма предпринимал еще в 1907 году Росс Гаррисон, помещавший фрагменты тканей в висячую каплю лимфы. Это был простейший сосуд, фактически предметное стекло, но именно он доказал саму возможность поддерживать жизнь клеток in vitro. Следующий прорыв случился в 1950-х годах, когда Джонас Солк разрабатывал вакцину против полиомиелита. Ему понадобились миллионы клеток почек обезьян, что потребовало перехода от плоских флаконов к вращающимся бутылям и первым промышленным аппаратам. В 1960-е годы появились системы с механическим перемешиванием, а в 1980-е с развитием гибридомной технологии и производством моноклональных антител началась эра высокоавтоматизированных установок с компьютерным управлением. Сегодня это сложные комплексы, где датчики в реальном времени отслеживают десятки параметров, а подача питательных веществ и удаление отходов происходят без участия человека.

Разнообразие клеточных линий породило и разнообразие аппаратов. Классификация строится по двум осям: тип клеток и способ культивирования. Суспензионные линии, например клетки CHO, выращиваемые для производства терапевтических белков, легко растут во взвешенном состоянии в ёмкостях с мешалкой. Для адгезионных клеток, которым нужна поверхность для прикрепления, применяют роллерные флаконы, вращающиеся вокруг горизонтальной оси, или аппараты с микроносителями. Отдельная категория, перфузионные системы, где свежая среда постоянно протекает через камеру с клетками, обеспечивая высокую плотность популяции. При этом один и тот же тип аппарата может использоваться для разных задач, но конструктивные решения внутри него будут отличаться кардинально.

Практическая ценность биореакторов для клеток животных огромна. Без них невозможно промышленное производство большинства современных вакцин, включая те, что разрабатывались против COVID-19. Помимо вакцин, в таких установках нарабатывают моноклональные антитела для терапии рака и аутоиммунных заболеваний, а также рекомбинантные факторы свёртывания крови, инсулин и другие биопрепараты. Мировой рынок биореакторов для клеточных культур оценивается в миллиарды долларов, и его рост напрямую связан с увеличением спроса на биологические лекарства. Именно поэтому совершенствование этих устройств остаётся одной из ключевых задач клеточной инженерии.

2. Конструкции биореакторов для клеток

Клетки животных принципиально отличаются от микробных культур: у них нет клеточной стенки, они крупнее и чувствительнее к механическим воздействиям. Поэтому выбор конструкции реактора сводится к одному вопросу: как обеспечить газообмен и перемешивание, не повредив при этом мембраны. Ответ зависит от того, растут ли клетки в свободном плавании или нуждаются в поверхности для прикрепления.

Суспензионные биореакторы работают с клетками, адаптированными к росту в жидкой среде без подложки. Классическая схема, описанная в материалах BIORUS, это сосуд с мешалкой (stirred-tank). Импеллер создает поток, который поддерживает клетки во взвешенном состоянии и выравнивает концентрации питательных веществ. Проблема в том, что лопасти мешалки создают сдвиговые нагрузки, губительные для млекопитающих. Решение нашли в использовании морских импеллеров с наклонными лопастями, которые генерируют более щадящий осевой поток при низких оборотах. Для аэрации применяют барботаж, подачу воздуха через пористые распылители, но пузырьки при схлопывании создают локальные пики напряжения. Чтобы избежать гибели клеток, в среду добавляют плюроник F68, который стабилизирует пузырьковую пленку.

Отдельная ветвь суспензионных систем, набирающая популярность с середины 2010-х, это одноразовые биореакторы. Они представляют собой мешок из многослойной медицинской пленки, закрепленный на качающейся платформе или снабженный встроенной мешалкой без вала. Компания Thermo Fisher называет такие системы Wave Bioreactor. Их преимущество очевидно: нет необходимости в стерилизации паром, что сокращает время между циклами и исключает риск перекрестного загрязнения. Однако объем таких мешков редко превышает 500 литров, что ограничивает их применение в крупнотоннажном производстве.

Совершенно иная задача стоит перед адгезионными биореакторами. Большинство линий, например фибробласты или клетки эпителия, не могут делиться в суспензии, им нужна твердая поверхность. Самый простой инструмент, роллерный флакон, это горизонтальный цилиндр, медленно вращающийся вокруг своей оси. Клетки прилипают к внутренней стенке и периодически погружаются в среду, что обеспечивает газообмен. Метод надежен, но трудоемок: чтобы получить промышленные объемы, нужны тысячи бутылей, а ручной труд по их обслуживанию колоссален.

Более эффективное решение, микроносители, впервые предложенное в 1967 году Ван Везелем, радикально изменило индустрию. Это сферические гранулы диаметром 100-300 мкм из декстрана, полистирола или коллагена. Плотность подобрана так, чтобы гранулы легко поддерживались во взвешенном состоянии слабым перемешиванием. Один грамм сухих микроносителей обеспечивает площадь поверхности около 5-6 квадратных метров. Таким образом, в стандартном реакторе объемом 100 литров можно получить биомассу, сопоставимую с тысячью роллерных флаконов. Клетки растут на поверхности гранул монослоем, а сама система по сути является гибридом суспензионной и адгезионной технологии.

Для особо чувствительных клеток, таких как гепатоциты, которые быстро теряют свои функции вне организма, разработаны системы с полыми волокнами. Устройство состоит из пучка полупроницаемых капилляров, запаянных в цилиндрический корпус. Клетки заселяются в пространство между волокнами, а питательная среда прокачивается внутри капилляров. Мембрана пропускает питательные вещества и продукты метаболизма, но задерживает крупные молекулы, например антитела, которые накапливаются в экстракапиллярном пространстве. Это позволяет получать продукты в высокой концентрации, но создает серьезные градиенты кислорода вдоль волокна. В работе CelliGen и подобных системах клетки живут неделями, что делает такие реакторы идеальными для производства малых объемов дорогих

терапевтических белков.

Перфузионные биореакторы выделяются не столько конструкцией, сколько режимом работы. Принцип, описанный в обзоре Millab Group, заключается в непрерывном протоке свежей среды через культуру с одновременным удалением отработанной. Клетки при этом удерживаются внутри с помощью фильтров, акустических сепараторов или гравитационных осадителей. В результате плотность клеток в перфузии достигает 50-100 миллионов на миллилитр, тогда как в периодическом режиме этот показатель редко превышает 5 миллионов. Высокая плотность означает, что продукт, например моноклональное антитело, накапливается в реакторе в течение многих дней, что снижает размер оборудования. Однако перфузионные системы требуют сложной автоматизации: насосы, весы и контроллеры уровня должны работать синхронно, иначе среда переполнит сосуд или клетки останутся без питания.

Сравнение трех подходов показывает жесткие компромиссы. Суспензионные реакторы с мешалкой остаются золотым стандартом для клеток CHO (яичник китайского хомячка), которые легко адаптируются к росту в жидкой среде и выдерживают сдвиговые нагрузки. Они просты в масштабировании, но требуют дорогих сред и дают относительно низкий выход продукта на литр. Адгезионные системы с микроносителями незаменимы для клеток, которые не растут в суспензии, например для мезенхимальных стволовых клеток, используемых в клеточной терапии. Но отделение клеток от носителей ферментами повреждает их, а сам процесс сложен для валидации. Полые волокна, по данным BiopharmaSolution, остаются нишевым решением для медленно растущих клеток с высоким выходом продукта, но их невозможно масштабировать линейно из-за ограничений массопереноса. Перфузия, несмотря на техническую сложность, становится стандартом в производстве дорогих биопрепаратов, где высокая плотность клеток оправдывает затраты на оборудование и контроль.

3. Контроль параметров и режимы работы

Клетки животных живут в узком коридоре физико-химических условий. Отклонение от него на пару градусов или пол-единицы pH останавливает рост, а то и запускает апоптоз. Поэтому контроль параметров в таком биореакторе не опция, а фундамент процесса. Температуру поддерживают на уровне 37°C с точностью до десятых долей градуса. pH держат в диапазоне 7,0-7,4. Сдвиг в кислую сторону возникает из-за накопления лактата, в щелочную, из-за выделения CO₂. Система автоматически добавляет щелочь или кислоту, но чаще просто меняет скорость подачи кислорода и азота в газовую смесь.

Растворенный кислород, отдельная история. Для клеток млекопитающих его концентрация критична: ниже 20% насыщения начинается гипоксия, выше 80%, токсичность активных форм. Оптимум обычно лежит в районе 30-50%. Поддерживать его сложно, потому что потребление кислорода клетками меняется по ходу роста. На помощь приходят каскадные контроллеры: сначала увеличивается скорость вращения мешалки, затем расход воздуха, и только потом в смесь добавляют чистый кислород. Перемешивание, кстати, решает сразу две задачи: гомогенизирует среду и разбивает пузырьки газа. Но у него есть тёмная сторона, сдвиговые нагрузки.

Клетки животных лишены клеточной стенки, поэтому турбулентные потоки и лопасти мешалки действуют на мембрану напрямую. При высоких оборотах гибнут даже адаптированные суспензионные линии. Минимизируют урон несколькими способами. Во-первых, используют мешалки с наклонными лопастями, создающие щадящее осевое перемешивание. Во-вторых, снижают скорость вращения до минимально необходимой, ориентируясь на показания датчиков. В-третьих, заменяют барботаж на мембранную аэрацию: газ проходит через силиконовые трубки, не образуя пузырьков, которые лопаются у поверхности и убивают клетки. Именно поэтому в конструкциях, описанных во второй главе, так много

внимания уделялось геометрии импеллера и способу подачи газа.

Теперь о режимах работы. Классический периодический процесс прост: засеяли, вырастили, собрали. Он хорош для отработки методик, но неэффективен: питательные вещества истощаются, а отходы накапливаются. На практике его вытесняет fed-batch, режим с подпиткой. В нём концентраты глюкозы, глутамина и других субстратов добавляют порциями по мере роста. Это позволяет обойти ингибирование метаболитами и поднять плотность клеток с 2-3 млн до 10-20 млн на миллилитр. По данным BIORUS, именно fed-batch стал стандартом для производства моноклональных антител.

Перфузионный режим идёт дальше: свежая среда поступает непрерывно, а отработанная удаляется с той же скоростью, при этом клетки остаются в реакторе. Для удержания используют фильтры, акустические сепараторы или осаждение. Плотность клеток достигает 50-100 млн на миллилитр, что в десятки раз выше, чем в периодике. Перфузия незаменима для получения термолабильных продуктов, которые разрушаются в условиях накопления. Но цена вопроса, сложность оборудования и высокий расход среды.

Онлайн-датчики превращают биореактор из сосуда с мешалкой в интеллектуальную систему. Современные приборы измеряют pH, pO₂ и температуру без отбора проб. Оптические датчики работают на основе флуоресценции, их стерилизуют вместе с реактором и не требуют калибровки в процессе. Рамановская спектроскопия позволяет следить за концентрацией глюкозы, лактата и даже плотностью клеток в реальном времени. Эти данные поступают в контроллер, который корректирует подачу среды и газов без участия оператора. Автоматизация особенно важна в перфузии, где ошибка в скорости потока за минуты может смыть всю культуру.

Современные системы, например, от Sartorius или Eppendorf, объединяют все эти контуры в единый интерфейс. Задача оператора сводится к настройке параметров и контролю аварийных сигналов. Но даже идеальная автоматизация не отменяет

необходимости понимать физиологию клеток: датчики лишь сообщают, что происходит, а интерпретировать это по-прежнему должен человек.

4. Масштабирование и перспективы развития

Переход от лабораторной колбы к реактору на тысячи литров не сводится к простому увеличению пропорций. Возникает принципиальный конфликт: то, что идеально работает на 10 литрах, на 1000 литров может убить культуру. Первая и главная проблема, гомогенность. В малом объеме перемешивание создает почти однородную среду, а в большом объеме жидкости появляются зоны с разным pH, концентрацией кислорода и питательных веществ. Клетки в центре и у стенки существуют в разных условиях, что ведет к неоднородности продукта и падению выхода целевого белка.

Вторая критическая точка, массоперенос. Пока объем мал, кислород успевает диффундировать из пузырьков воздуха во всю толщу среды. В промышленном масштабе диффузия бессильна, и приходится полагаться только на механическое перемешивание и барботаж. Но чем агрессивнее перемешивание, тем выше сдвиговые нагрузки, которые разрушают мембраны клеток. Инженеры оказываются в ловушке: нужно доставить кислород, не повредив культуру. Градиенты концентраций, особенно углекислого газа, усугубляют положение: в больших реакторах CO₂ накапливается в нижних слоях, подкисляя среду локально.

Классический подход к масштабированию, геометрическое подобие. Реактор увеличивают, сохраняя пропорции мешалки, диаметра и высоты. Это просто, но недостаточно: при таком копировании удельная мощность перемешивания падает, и кислородное обеспечение ухудшается. На практике чаще ориентируются на постоянство объемного коэффициента массопередачи kLa, то есть скорости переноса кислорода из газа в жидкость. Если в лаборатории kLa равен 10 в час, то в промышленном масштабе подбирают условия, чтобы сохранить эту цифру. Но и здесь есть подвох: kLa зависит от множества параметров, и его расчет для больших объемов требует эмпирических корреляций, которые не всегда точны.

Современный инструмент, CFD-моделирование (вычислительная гидродинамика). Численные методы позволяют рассчитать распределение скоростей, напряжений сдвига и концентраций внутри реактора еще до его постройки. Программы вроде Ansys Fluent или COMSOL дают инженеру виртуальную картину потоков, показывая мертвые зоны и области с недостаточным перемешиванием. Это способ протестировать разные конфигурации мешалок и расположения барботеров за недели, а не за годы экспериментов. CFD особенно ценен при переходе на новые типы клеток, где эмпирические данные отсутствуют.

Современные тенденции смещают акцент с увеличения объема на интеллектуализацию процесса. Одноразовые биореакторы из стерильных пластиковых мешков уже не экзотика, а стандарт для производства вакцин и персонализированной терапии. Они исключают этап мойки и стерилизации, сокращая время между партиями. Производители вроде Sartorius и Cytiva предлагают системы от 50 до 2000 литров, которые разворачиваются за дни. Автоматизация замыкает контур управления: датчики в реальном времени передают данные в систему, которая сама корректирует подачу питательных веществ и кислорода. Интеграция с downstream-процессами (очисткой и выделением продукта) позволяет перейти от дискретных стадий к непрерывному производству, что снижает затраты на 30-40%.

Перспективы развития лежат за пределами классических суспензионных культур. 3D-культивирование, где клетки растут в каркасах, имитирующих тканевую структуру, открывает путь к созданию сложных биологических продуктов, включая искусственные ткани для трансплантологии. Органо-на-чипе технологии, объединяющие микрофлюидику и живые клетки, позволяют моделировать физиологию целых органов в масштабе чипа. Эти системы не заменят большие реакторы, но они способны радикально ускорить скрининг лекарств, сократив потребность в животных моделях. Остается открытым вопрос, как масштабировать такие микросистемы до промышленных объемов, не потеряв их

физиологической достоверности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биореакторы для культур клеток - BIORUS — https://bio-rus.ru/stati/bioreaktoryi-dlya-kultur-kletok.html

2. Виды биореакторов | Millab Group — https://millab.ru/press-tsentr/articles/bioreaktory-dlya-kultur-kletok-vidy-bioreaktorov/

3. Эффективный биореактор для культивирования клеток — https://apni.ru/article/2678-effektivnij-bioreaktor-dlya-kultivirovaniya

4. Биореактор для животных клеток | cGMP — https://www.biopharmasolution.com/ru/application/animal-cell-bioreactor

5. Волоконный дисковый биореактор — https://www.biopharmasolution.com/ru/cellipower06

6. Классификация и структура биореакторов — https://ru.laboao.com/news/technical-knowledge/do-you-know-the-classification-and-structure-of-mammalian-cell-bioreactors

7. Биореакторы для культивирования клеток — https://technovis.ru/o-kompanii/info/bioreaktory-dlya-kultivirovaniya-kletok/

8. Культивирование клеток и тканей — https://biomirix.ru/products/upstream-bioprocess-cell-culture-products/