Методы культивирования стволовых клеток in vitro

Содержание

1. 1. Стволовые клетки: типы и потенциал3
2. 2. Классические 2D-системы культивирования6
3. 3. 3D-культивирование и скаффолды8
4. 4. Биореакторы и контроль условий10
5. Список литературы13

1. Стволовые клетки: типы и потенциал

Стволовые клетки отличаются от остальных клеток организма двумя свойствами: они могут самообновляться и дифференцироваться. Самообновление, это способность клетки при делении производить как минимум одну дочернюю клетку, которая сохраняет стволовый статус. Дифференцировка, это процесс специализации, когда клетка приобретает уникальную морфологию и функции, превращаясь, например, в нейрон, кардиомиоцит или гепатоцит. На этих двух характеристиках основано определение стволовой клетки, которое дали Эрнест Маккаллох и Джеймс Тилл. Они впервые показали существование таких клеток в костном мозге мышей в 1960-х годах.

По происхождению стволовые клетки делят на три категории. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы бластоцисты (это зародыш на стадии 5-7 дней развития). У мышей их впервые выделили Мартин Эванс и Мэтью Кауфман в 1981 году, а у человека, Джеймс Томсон в 1998-м. Взрослые, или соматические, стволовые клетки находятся в тканях зрелого организма. Их задача, репарация: гемопоэтические стволовые клетки костного мозга постоянно обновляют пул клеток крови, а мезенхимальные стволовые клетки (их описал Александр Фриденштейн) участвуют в восстановлении костной, хрящевой и жировой тканей. Отдельная категория, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). В 2006 году Синъя Яманака с коллегами обнаружил, что введение четырёх транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) в соматическую клетку возвращает её в плюрипотентное состояние, похожее на эмбриональное. За это открытие Яманака получил Нобелевскую премию в 2012 году, и оно сняло этические проблемы, связанные с разрушением эмбрионов.

Если классифицировать клетки по дифференцировочному потенциалу, виден спектр возможных направлений развития. Тотипотентными считаются зигота и клетки ранней морулы: они могут дать начало и всем тканям эмбриона, и

экстраэмбриональным структурам (например, плаценте). Плюрипотентные клетки (ЭСК и ИПСК) способны дифференцироваться в клетки трёх зародышевых листков, но не формируют внезародышевые оболочки. Мультипотентные стволовые клетки (гемопоэтические, мезенхимальные) ограничены несколькими родственными типами клеток в пределах одной ткани. Унипотентные клетки, такие как клетки-предшественники эпидермиса, дают начало лишь одному типу. Этот спектр, от тотипотентности до унипотентности, представляет собой иерархию, где клетки постепенно утрачивают пластичность по мере развития.

Баланс между самообновлением и дифференцировкой делает стволовые клетки удобным объектом для культивирования in vitro. Вне организма их можно изучать в контролируемых условиях, чего не добиться в целостном животном. Методы in vitro позволяют проследить молекулярные события, которые управляют выбором судьбы клетки: какие сигнальные пути включаются при переходе от плюрипотентного состояния к специализированному. В экспериментах по направленной дифференцировке ЭСК в нейроны учёные добавляют в среду ретиноевую кислоту и факторы роста, имитируя градиенты концентраций в нервной трубке эмбриона. Наблюдение за этими процессами в чашке Петри дало ключевые данные о механизмах гаструляции и органогенеза, которые этичными методами на человеке получить невозможно.

В регенеративной медицине практическая ценность культивирования видна особенно ясно. Чтобы получить нужное количество клеток для трансплантации (скажем, при лечении повреждённого миокарда или дегенерации роговицы), их приходится размножать in vitro. Работы по лимбальным эпителиальным стволовым клеткам показывают: культивирование позволяет увеличить число клеток и проверить их функциональность перед пересадкой пациенту. Если бы не системы культивирования, поддерживающие плюрипотентность и контролирующие дифференцировку, применение стволовых клеток в клинике оставалось бы

теоретической возможностью. Поэтому глава закладывает основу для разговора о конкретных технологиях: именно тип клеток и их потенциал определяют, какой метод культивирования выбрать в каждой задаче.

2. Классические 2D-системы культивирования

Классическая 2D-система остается той базой, на которой построены протоколы работы со стволовыми клетками. Суть метода проста: клетки выращивают на плоской поверхности чашки Петри или планшета, где они образуют монослой. Вся методология, от состава среды до типа подложки, сводится к воспроизведению минимально необходимых условий для поддержания клеток в недифференцированном состоянии. При этом питательная среда выступает не просто источником питания, а сложным химическим конструктором.

Базальная среда (например, DMEM или DMEM/F12) снабжает клетки ионами, аминокислотами и витаминами. Однако без добавления сыворотки, чаще всего эмбриональной телячьей, пролиферация практически останавливается. В сыворотке содержатся гормоны, белки-переносчики и липиды, которые в совокупности стимулируют деление. Ее доля в среде колеблется от 5% до 20%, и именно она вносит основную неопределенность в эксперимент, так как состав сыворотки нестабилен и зависит от партии. Чтобы снизить риск контаминации, в среду добавляют антибиотики, например пенициллин со стрептомицином, хотя при работе с клетками для последующей трансплантации их использование стараются минимизировать.

Отдельного внимания заслуживает субстрат, на котором клетки адгезируют. Ранние протоколы полагались на фидерный слой из митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов. Эти клетки создают внеклеточный матрикс и выделяют в среду набор факторов, напрямую подавляющих спонтанную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток. В современных работах по клеточной инженерии фидеры все чаще заменяют на бесклеточные матрицы. Matrigel, получаемый из саркомы мыши, остается золотым стандартом за счет содержания ламинина, коллагена IV и энтактина. Правда, его неопределенный состав и гетерогенность заставляют искать альтернативы. Рекомбинантный ламинин-511 дает возможность создать полностью определенную

среду, что критически важно для клинического применения.

Из факторов роста, определяющих судьбу клетки, в 2D-системах доминируют два. Для человеческих эмбриональных стволовых клеток и iPSC основным регулятором служит bFGF. Он активирует сигнальные пути, которые стимулируют пролиферацию и блокируют дифференцировку. Обычно концентрация bFGF в среде составляет 4-10 нг/мл, хотя отдельные протоколы требуют повышения до 100 нг/мл для поддержания плюрипотентности. Для мышиных клеток функцию ингибитора дифференцировки выполняет LIF. Этот интерлейкин связывается с рецептором gp130 и активирует путь JAK/STAT3, что напрямую способствует самообновлению. Показательно, что LIF не работает на человеческих клетках, что указывает на видовые различия в механизмах регуляции.

При всей своей распространенности 2D-культуры имеют фундаментальные ограничения. Клетки на плоской подложке находятся в условиях, далеких от физиологических. Они теряют естественную полярность, а контакт с матриксом у них ограничен только базальной поверхностью. Это влечет за собой изменения цитоскелета, метаболизма и экспрессии генов. Например, мезенхимальные стволовые клетки при длительном пассировании на пластике постепенно утрачивают потенциал к остеогенной дифференцировке и приобретают признаки стареющих фибробластов. Плоскостная архитектура не позволяет формироваться сложным тканевым структурам вроде сосудистых сетей, а диффузия питательных веществ и кислорода через слой среды создает градиенты, которых в реальной ткани просто нет. Все это заставляет исследователей относиться к 2D-системе лишь как к отправной точке, тогда как воспроизведение истинной ниши стволовой клетки требует перехода к объемным культурам.

3. 3D-культивирование и скаффолды

Если классическая 2D-система сводит жизнь клетки к плоскому монослою на пластике, то трёхмерное культивирование возвращает её в условия, приближенные к организму. В объёмной культуре клетки контактируют друг с другом со всех сторон, выстраивают полярность и формируют архитектуру, похожую на нативную ткань. На поведение стволовых клеток влияют именно эти взаимодействия, а не просто геометрия субстрата. Они кардинально меняют их судьбу.

Ключевой инструмент 3D-подхода, скаффолды. Это трёхмерные каркасы, замещающие внеклеточный матрикс. Их задача, удержать клетки в пространстве и передать им механические и биохимические сигналы. Природные скаффолды из коллагена или гиалуроновой кислоты наследуют биосовместимость и лиганды, которые клетка узнаёт без дополнительных усилий. Однако их сложно стандартизировать. Синтетические аналоги из полиэтиленгликоля (PEG) или полилактид-ко-гликоля (PLGA) лишены этого недостатка. Их пористость и жёсткость можно воспроизводимо настраивать под конкретную задачу. Выбор между этими типами каркасов, компромисс: приходится решать, что важнее, биологическая естественность или технологический контроль.

Отдельная ниша, гидрогелевые матрицы. Это водонасыщенные полимерные сети, позволяющие тонко регулировать жёсткость микроокружения. Стволовые клетки чувствительны к механическим свойствам субстрата. На мягких гелях, имитирующих мозг, они склоняются к нейрогенной дифференцировке. На более жёстких, похожих на костную ткань, к остеогенной. Гидрогели дают исследователю рычаг управления: можно менять не химический состав среды, а физику окружения.

Когда клеткам позволяют самоорганизоваться без внешнего каркаса, они формируют сфероиды. Это плотные агрегаты, в которых воспроизводятся

межклеточные контакты и градиенты питательных веществ. Более сложный уровень, органоиды. Они представляют собой миниатюрные модели органов, развиваются из стволовых клеток и содержат несколько типов клеток, организованных в структуры, напоминающие реальный орган. Наиболее известные примеры, церебральные органоиды из плюрипотентных клеток для моделирования нейродегенеративных заболеваний и кишечные органоиды для изучения регенерации эпителия.

Влияние 3D-микроокружения на судьбу клетки трудно переоценить. В объёмной культуре мезенхимные стволовые клетки дольше сохраняют фенотип и способность к самообновлению, чем на плоской подложке. Причина в том, что трёхмерная архитектура восстанавливает естественные сигнальные пути, которые активируются при взаимодействии клетки с матриксом и соседями. Исследования, опубликованные в журнале «Цитология», показывают, что МСК человека в 3D-культуре демонстрируют более высокую экспрессию маркеров стволовости и устойчивость к апоптозу. Получается, объёмное культивирование, это не техническое усовершенствование. Это способ вернуть клеткам физиологический контекст, который теряется при переносе в чашку Петри.

4. Биореакторы и контроль условий

Когда плоская чашка Петри перестаёт отвечать задачам эксперимента, на сцену выходят биореакторы. Это не просто увеличенные версии лабораторных планшетов, а принципиально иные системы, спроектированные для создания гомогенной и воспроизводимой среды в объёме от десятков миллилитров до сотен литров. Их работа строится на четырёх базовых процессах: перемешивание, аэрация, поддержание pH и температуры.

Перемешивание решает сразу две задачи. Оно выравнивает концентрации питательных веществ и кислорода по всему объёму, а также предотвращает оседание клеток на дно, где они слипаются в агрегаты и теряют жизнеспособность. Мешалка с лопастями, вращающаяся с частотой 30-80 оборотов в минуту, создаёт ламинарный поток, щадящий для клеточных мембран. Однако слишком интенсивное перемешивание порождает сдвиговые напряжения, которые повреждают клетки. Поэтому дизайн импеллера и скорость вращения подбираются под конкретный тип культуры.

Аэрация в биореакторах устроена сложнее, чем простое открытие крышки. Для подачи кислорода используют мембранные модули или микробарботаж, когда в среду через пористые трубки подаются пузырьки газа. Пузырьки должны быть мелкими, диаметром менее 1 мм, иначе их схлопывание создаёт ударные волны, губительные для клеток. Именно поэтому в современных системах всё чаще применяют перфторуглеродные эмульсии, способные растворять кислород в десятки раз эффективнее воды, или силиконовые мембраны, через которые газ диффундирует без образования пузырьков.

Контроль pH в биореакторе опирается на датчики и автоматические насосы. Клетки в процессе метаболизма выделяют углекислоту и лактат, закисляя среду. Система подкачивает раствор бикарбоната натрия, а при сдвиге в щелочную сторону добавляет углекислый газ в газовую смесь. Температуру удерживают в пределах 37°C с помощью водяной

рубашки или электрического нагревателя, а точность термостатирования составляет ±0,1°C.

Конструктивно биореакторы делятся на три основных типа. Вращающиеся системы, например, с вращающимся сосудом, имитируют условия микрогравитации и позволяют клеткам формировать трёхмерные агрегаты в условиях низких сдвиговых нагрузок. Перфузионные биореакторы прокачивают свежую среду через камеру с клетками непрерывно, одновременно удаляя продукты метаболизма. Такой режим обеспечивает постоянство состава среды и особенно важен для поддержания плюрипотентности. Реакторы с мешалкой, классические для микробиологии, адаптированы под клетки млекопитающих за счёт использования лопастей с наклоном и покрытия внутренних поверхностей силиконом, препятствующим адгезии клеток к стенкам.

Переход от статических 2D-культур к биореакторам даёт ключевое преимущество: масштабируемость. В чашке Петри можно вырастить лишь миллионы клеток, тогда как для клинического применения, например, для трансплантации, требуются сотни миллионов. В биореакторах мезенхимальные стволовые клетки удаётся размножить в 20-50 раз быстрее при том же качестве продукции, как показано в работах по культивированию в волновых биореакторах (данные Esco Aster). При этом каждый цикл производства сопровождается автоматическим протоколированием параметров, что критично для соблюдения стандартов GMP.

Однако простое масштабирование не решает главную задачу: сохранение стволового статуса клеток. Микроокружение в биореакторе должно точно воспроизводить нишу, где клетки поддерживают плюрипотентность. Для этого в перфузионных системах непрерывно дозируют факторы роста, такие как bFGF, концентрацию которых в проточном режиме сложнее контролировать, чем в статике. Мониторинг уровня кислорода особенно важен: гипоксия (5% O₂) способствует самообновлению, тогда как нормальный уровень кислорода (21%)

запускает дифференцировку. Современные биореакторы оснащены оптическими датчиками кислорода, которые передают данные в режиме реального времени, позволяя корректировать газовый поток без отбора проб.

Направленная дифференцировка в биореакторе требует смены программного обеспечения. Например, при получении кардиомиоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток используют биореакторы с мешалкой, где формируются эмбриоидные тела. Меняя состав среды через заданные интервалы времени, система управляет последовательным включением генов, отвечающих за сердечную судьбу клеток. Автоматизация здесь выходит на новый уровень: протокол задаётся заранее, и биореактор сам переключает питательные среды, меняет концентрации факторов и скорость перемешивания.

Перспективы развития биореакторных технологий связаны с тремя направлениями. Первое, полная автоматизация циклов: от загрузки клеток до сбора конечного продукта без вмешательства оператора. Второе, интеграция биореакторов с трёхмерными носителями, где клетки растут на микроносителях или внутри пористых структур, что позволяет увеличить площадь поверхности в единице объёма. Третье, переход к закрытым системам для клинического применения, где клетки проходят все этапы производства в одном устройстве без риска контаминации. Клинические испытания с использованием биореакторных продуктов уже ведутся для лечения повреждений роговицы и восстановления хряща, что подтверждает состоятельность такого подхода.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сборник материалов: культивирование мезенхимных стволовых клеток на полилактидных скаффолдах — http://stemcellbio.ru/wp-content/uploads/2016/04/%D0%A2%D0%B5%D0%B7%D0%B8%D1%81%D1%8B_%D0%BA%D0%B0%D1%82%D0%B0%D0%BB%D0%BE%D0%B3-1.pdf

2. Трансплантат лимбальных эпителиальных стволовых клеток — https://www.stm-journal.ru/ru/numbers/2017/4/1386/html

3. Клеточная инженерия — https://www.books-up.ru/ru/excerpt/kletochnaya-inzheneriya-13833022/

4. Регенеративная биология и медицина. Генные технологии и клонирование — https://www.directmedia.ru/book-714037-regenerativnaya-biologiya-i-meditsina-gennyie-tehnologii/

5. Разработка метода трехмерного культивирования МСК человека — http://tsitologiya.incras.ru/65_2/abstract-170_180_ru.pdf

6. Вестник Российской военно-медицинской академии — https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/download/25982/20129

7. Мезенхимальные стволовые клетки. Достижения и перспективы — https://www.directmedia.ru/book-708012-mezenhimalnyie-stvolovyie-kletki-dostijeniya/

8. Культивация и распространение мезенхимальных стволовых клеток в биореакторах — https://www.escoaster.com/assets/downloads/file/cultivation-and-expansion-of-human-mesenchymal-stem-cells-in-tide-motion-bioreactors-russian.pdf