Методы селекции микроорганизмов для получения антибиотиков

Содержание

1. 1. Антибиотики и проблема продуктивности3
2. 2. Классический мутагенез и отбор6
3. 3. Генная инженерия продуцентов8
4. 4. Скрининг и перспективы селекции10

1. Антибиотики и проблема продуктивности

Антибиотики, это вторичные метаболиты микроорганизмов. Проще говоря, соединения, которые не нужны клетке для основного обмена веществ, но дают продуценту преимущество в борьбе за существование. Они подавляют рост бактерий или грибов. Именно это свойство и легло в основу современной медицины. Пенициллин, стрептомицин, тетрациклин и сотни других соединений спасли миллионы жизней, начиная с середины XX века. Благодаря промышленной микробиологии открытие Александра Флеминга превратилось в глобальную индустрию с оборотом в десятки миллиардов долларов.

Природные штаммы-продуценты, например Penicillium chrysogenum или Streptomyces griseus, синтезируют антибиотики в очень небольших количествах. В естественных условиях выход вторичных метаболитов измеряется миллиграммами на литр культуральной жидкости. Этого достаточно, чтобы подавить конкурентов в почве, но совершенно недостаточно для коммерческого производства. Когда в 1940-х годах встал вопрос о массовом выпуске пенициллина для армии, исходный штамм Флеминга давал около 2 единиц на миллилитр. Современные промышленные штаммы продуцируют более 50 000 единиц на миллилитр. Эта тысячекратная разница не возникла сама собой. Она стала результатом целенаправленной работы селекционеров.

Проблема продуктивности носит фундаментальный характер. Клетка не заинтересована в избыточном синтезе антибиотика: это требует затрат энергии и ресурсов, которые можно было бы направить на рост. Поэтому в ходе эволюции закрепились механизмы жесткой регуляции биосинтеза. Задача селекции, сломать эту регуляцию или обойти её. Работа ведется по нескольким направлениям: повышение продуктивности, стабильность наследственных признаков и технологичность штамма. Последнее включает устойчивость к условиям глубинного культивирования, пенообразованию, фаговым инфекциям, а также способность

синтезировать целевой продукт без примесей, затрудняющих очистку.

Путь от случайной находки к систематической работе занял десятилетия. В 1928 году Флеминг заметил лизис бактерий вокруг колонии плесневого гриба, но его наблюдение осталось лабораторным курьезом. Только в начале 1940-х годов группа Говарда Флори и Эрнста Чейна в Оксфорде выделила пенициллин в чистом виде и показала его терапевтическую эффективность. Тогда же начались первые попытки повысить выход продукта. Зельман Ваксман, открывший стрептомицин в 1943 году, создал систематический подход к поиску антибиотиков среди почвенных актиномицетов. Именно он ввел в практику целенаправленный скрининг микроорганизмов, а его ученики разработали методы отбора вариантов с повышенной продуктивностью.

Ключевым прорывом стала идея о том, что продуктивность можно наследовать и усиливать. В 1940-х годах полагались на естественную изменчивость: отбирали спонтанные мутанты, дающие больший выход пенициллина. Метод был медленным, но работал. К 1950-м годам селекционеры осознали, что для ускорения процесса нужны индуцированные изменения. Однако рассказ об этих методах выходит за рамки данной главы. Здесь важно зафиксировать главное: без селекции природные продуценты остаются малопригодными для промышленности. Любой современный штамм, используемый на фармацевтических заводах, несет в себе результат десятилетий отбора и десятков последовательных мутаций.

Проблема низкой природной продуктивности не решена окончательно и сегодня. Каждый новый антибиотик, открытый в природе, требует той же работы: от исходного дикого штамма до коммерческого варианта. Исключений нет. Даже при использовании современных молекулярных инструментов отправной точкой остается природный организм с его скромными возможностями. Поэтому селекция микроорганизмов-продуцентов остается обязательным этапом разработки любого

антибиотика, и именно её методы определяют экономическую целесообразность производства.

2. Классический мутагенез и отбор

Классическая селекция микроорганизмов-продуцентов опирается на простую логику: сперва создать генетическое разнообразие, затем выбрать из него лучших варианты. Естественная частота спонтанных мутаций слишком мала, чтобы можно было рассчитывать на промышленно значимые улучшения. Поэтому селекционеры используют индуцированный мутагенез, который повышает вероятность изменений в генах биосинтеза антибиотиков в десятки и сотни раз.

В распоряжении исследователей имеются физические и химические агенты. УФ-облучение повреждает ДНК, приводя преимущественно к заменам азотистых оснований. Химические мутагены действуют более прицельно. Нитрозогуанидин, к примеру, вызывает множественные мутации вблизи репликативной вилки, что удобно для «бомбардировки» кластеров генов биосинтеза. Этилметансульфонат алкилирует гуанин, провоцируя транзиции. Спектр повреждений у каждого агента свой, поэтому на практике их часто комбинируют, чтобы охватить геном шире.

После обработки мутагеном популяция становится гетерогенной. Задача в том, чтобы из тысяч колоний выделить те немногие, которые стали продуктивнее. Прямая оценка выхода антибиотика для каждой колонии слишком трудоёмка. Вместо этого применяют косвенные критерии. Один из них, устойчивость к аналогам предшественников. Если клетка выживает в присутствии токсичного структурного аналога субстрата биосинтеза, это часто указывает на то, что её ферменты стали эффективнее использовать именно этот путь. Другой распространённый приём, посев мутантов на плотную среду с тест-культурой чувствительного патогена. Продуцент с более высоким синтезом антибиотика образует вокруг колонии широкую зону подавления роста тест-микроба. Метод нагляден, дёшев и не требует сложного оборудования.

Повышение продуктивности редко случается одним скачком. Обычно одна мутация добавляет 10-20 процентов. Возникает задача накопить эти небольшие улучшения. Решение, ступенчатый отбор. Процедура циклична: культуру обработали мутагеном, отобрали лучший вариант, снова обработали, снова отобрали. Повторяя циклы, продуктивность штамма постепенно «вытягивают». Классический пример, работа с продуцентом пенициллина. Природный штамм Penicillium chrysogenum синтезировал лишь несколько единиц антибиотика на миллилитр среды. Многолетние циклы мутагенеза и селекции дали варианты с продуктивностью в тысячи раз выше исходной. Результат достигнут исключительно накоплением множества точечных мутаций, без вмешательства в геном на молекулярном уровне.

У подхода есть системные ограничения. Мутагенез ненаправлен. Помимо желаемых изменений в генах биосинтеза, возникают мутации в других участках генома, способные нарушить метаболизм, снизить скорость роста или изменить морфологию колоний. Часть мутантов нестабильна: после нескольких пересевов продуктивность падает. Скрининг тысяч колоний, это рутинная работа, требующая времени и терпения. Эффект от ступенчатого отбора со временем снижается: после определённого уровня продуктивности мутации с положительным эффектом встречаются всё реже. Каждый следующий шаг даётся труднее предыдущего, что заставляет искать более точные методы модификации генома.

3. Генная инженерия продуцентов

Классический мутагенез, при всех его достижениях, остается методом проб и ошибок. Он меняет гены вслепую и полагается на удачу при отборе. Генная инженерия предлагает принципиально иной путь: она позволяет вносить в геном продуцента точечные, заранее спланированные изменения. Вместо того чтобы ждать редкой полезной мутации, исследователь сам конструирует нужный признак. В этой главе рассматриваются четыре ключевых направления такой работы.

Первое из них, клонирование и амплификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза. В природном штамме скорость синтеза антибиотика часто ограничена количеством ключевого фермента, который катализирует самую медленную стадию пути. Если выделить этот ген, встроить его в многокопийную плазмиду и вернуть в клетку, число копий гена, а вместе с ним и количество фермента, возрастает в разы. Это снимает «узкое место» метаболического пути. Например, увеличение дозы гена гликозилтрансферазы в штамме-продуценте олеандомицина заметно подняло выход целевого продукта, поскольку завершающий этап его сборки стал проходить эффективнее. Поток метаболитов буквально «продавливается» через ферментативный каскад к конечному соединению.

Второй подход, гетерологичная экспрессия. Полный кластер генов биосинтеза у природного хозяина может занимать десятки тысяч пар нуклеотидов, и работать с ним часто бывает неудобно. Тогда его переносят в другой, генетически лучше изученный организм. Классический пример, штамм Streptomyces lividans, который служит универсальным «контейнером» для чужеродных кластеров. Он быстро растет на дешевых средах, легко поддается генетической трансформации, а его собственный метаболизм не мешает экспрессии чужеродных генов. Такой перенос упрощает культивирование, а кроме того, позволяет изучать работу биосинтетических генов в чистом виде, без фоновых процессов

исходного продуцента.

Третий инструмент, направленный мутагенез регуляторных генов. Синтез антибиотиков в клетке жестко контролируется: он включается только на определенной стадии роста и часто подавляется конечным продуктом по принципу отрицательной обратной связи. Сайт-специфический мутагенез дает возможность точечно изменять последовательность ДНК таких регуляторов, «выключая» репрессию. Мутация в гене-репрессоре, который блокирует транскрипцию биосинтетических генов, приводит к тому, что синтез антибиотика начинается раньше и идет непрерывно, не дожидаясь сигнала извне. Снятие естественного ограничения, наложенного эволюцией, позволяет клетке производить целевой продукт в гораздо большем объеме.

Наконец, метаболическая инженерия работает не с самими генами биосинтеза, а с их окружением. Антибиотик синтезируется из предшественников, которые клетка использует и для собственного роста. Задача метаболической инженерии, перенаправить поток углерода и энергии в нужное русло. Это достигается усилением синтеза предшественников (например, аминокислот или ацетил-КоА) либо устранением конкурирующих путей, которые расходуют эти же вещества впустую. Дополнительно можно увеличить доступность кофакторов, таких как NADPH, необходимых для восстановительных стадий биосинтеза. Оптимизация этих «тыловых» процессов повышает общий выход продукта, не меняя непосредственно структуру ферментов биосинтеза. В итоге генная инженерия превращает селекцию из поиска случайных улучшений в точное конструирование клеточного метаболизма под конкретную промышленную задачу.

4. Скрининг и перспективы селекции

Однажды создав генетическое разнообразие, исследователь упирается в другую стену: как среди тысяч мутантов найти того самого, кто синтезирует антибиотик в промышленно значимых количествах? Ручная проверка колоний на чашках Петри давно стала узким местом. На смену ей пришёл высокопроизводительный скрининг (HTS), который превращает отбор из кустарного ремесла в конвейерную индустрию. Роботизированные манипуляторы переносят отдельные клоны в 96- или 384-луночные микропланшеты, где каждый штамм растёт в изолированной среде, а автоматические ридеры снимают показатели продуктивности. За сутки такая система обрабатывает десятки тысяч образцов. Классический микробиолог за то же время справился бы с несколькими десятками.

Выбор детектора определяет всё. Классическая диффузия в агар, когда штамм высевают на газон тест-культуры и измеряют диаметр зоны подавления роста, остаётся надёжной, но низкопроизводительной. Для HTS чаще используют хроматографию с масс-спектрометрией: образец из лунки разделяется по компонентам, и масс-анализатор точно идентифицирует целевое соединение по молекулярной массе. Это позволяет отсеивать ложноположительные результаты, когда зона подавления вызвана не антибиотиком, а органической кислотой или другим побочным метаболитом. Есть и более элегантный подход, флуоресцентные репортеры. Если в геном продуцента встроить ген зелёного флуоресцентного белка под промотор, чувствительный к концентрации антибиотика, то интенсивность свечения напрямую коррелирует с продуктивностью. Сортировка таких клеток проточной цитометрией позволяет отбирать лучшие варианты в режиме реального времени, даже не разрушая клетки.

Дальнейшие перспективы лежат в области синтетической биологии. CRISPR/Cas9-технологии дают инструмент для точечного редактирования регуляторных областей генома. Куда интереснее их применение в эволюционной инженерии in

vitro. Учёные создают синтетические генные сети, которые связывают продукцию антибиотика с ростом клетки: только те мутанты, что синтезируют больше целевого соединения, выживают в конкурентной среде. Это превращает естественный отбор в союзника селекционера. Методом случайных мутаций в генах-мишенях с последующей селекцией на устойчивость к аналогам предшественников удалось повысить продуктивность штаммов Streptomyces clavuligerus по клавулановой кислоте более чем втрое, причём без единого раунда классического мутагенеза.

Синергия подходов очевидна. Классическая селекция накапливает полезные мутации в десятках генов одновременно, тогда как генная инженерия точечно исправляет конкретные звенья метаболического пути. Современные промышленные штаммы, например, продуценты эритромицина, несут следы десятков раундов случайного мутагенеза, а поверх них, направленные замены в генах регуляторов и ферментов биосинтеза. Именно такое комбинирование даёт тот самый синергетический эффект, когда продуктивность возрастает на порядки, а не на проценты. Впереди, автоматизированные платформы, где циклы мутагенеза, скрининга и редактирования генома замыкаются в петлю, работающую без участия человека, пока не будет достигнут целевой показатель выхода антибиотика.