Получение инсулина методами генной инженерии

Содержание

1. 1. Инсулин: история открытия и медицинское значение3
2. 2. Рекомбинантная ДНК: принципы конструирования5
3. 3. Экспрессия инсулина в бактериях и дрожжах7
4. 4. Преимущества и перспективы биотехнологического инсулина9
5. Список литературы11

1. Инсулин: история открытия и медицинское значение

Сахарный диабет знаком медицине с античных времен, однако до начала XX века этот диагноз фактически означал приговор. В 1921 году канадский хирург Фредерик Бантинг вместе с ассистентом Чарльзом Бестом выделил из поджелудочной железы собаки вещество, понижающее уровень глюкозы в крови. Этим веществом оказался инсулин, пептидный гормон, который синтезируют бета-клетки островков Лангерганса. Уже в январе 1922 года инсулин впервые ввели четырнадцатилетнему пациенту с тяжелой формой диабета, и мальчик пошел на поправку. Научное сообщество быстро оценило открытие: в 1923 году Бантинг и его научный руководитель Маклеод стали лауреатами Нобелевской премии по физиологии или медицине.

Молекула инсулина построена из двух полипептидных цепей (A и B), которые соединены дисульфидными мостиками. Для терапии диабета важен не только сам факт наличия гормона, но и точная пространственная конфигурация его молекулы. Долгое время единственным промышленным источником инсулина оставались поджелудочные железы крупного рогатого скота и свиней. Метод работал, но обладал серьезными недостатками. Сырья требовалось колоссальное количество: из тонны желез удавалось получить лишь около 100 граммов чистого гормона. Помимо этого, животный инсулин отличается от человеческого на одну-три аминокислоты, поэтому иммунная система пациентов часто отвечала на чужеродный белок выработкой антител. Встречались аллергические реакции, а эффективность терапии со временем снижалась. Существовал и риск заражения препарата вирусами или прионными белками, источником которых было животное сырье.

Логичной альтернативой выглядел химический синтез инсулина in vitro. Однако здесь возникла иная трудность: молекула слишком сложна для простого лабораторного конструирования. Чтобы две цепи правильно свернулись в

нативную структуру, требуются особые условия, а выход конечного продукта крайне мал. Себестоимость такого синтеза оказалась астрономической, а качество препарата оставалось нестабильным. Наладить массовое производство этим способом не удалось.

Достижения молекулярной биологии в 1970-х годах предложили другой путь. Вместо того чтобы извлекать гормон из тканей или собирать его в пробирке, исследователи решили заставить бактериальные клетки производить человеческий белок по заданной программе. Суть подхода сводилась к следующему: выделить ген инсулина человека, встроить его в генетический аппарат микроорганизма и получить таким образом биологический «завод». Генная инженерия снимала проблему нехватки сырья, убирала иммуногенность, вызванную видовыми отличиями, и гарантировала чистоту продукта. Первые успешные опыты по экспрессии человеческого инсулина в Escherichia coli провели в конце 1970-х годов, а уже в 1982 году новый препарат одобрили для клинического применения. Так биотехнология впервые продемонстрировала, что способна справляться с задачами, которые традиционная фармацевтика решить не могла.

2. Рекомбинантная ДНК: принципы конструирования

Рекомбинантная ДНК представляет собой молекулу, собранную в пробирке из фрагментов разного происхождения. Чтобы получить инсулин, такую конструкцию создают по отработанной схеме: сначала добыть ген, затем встроить его в вектор-носитель, доставить в клетку-хозяина и заставить её синтезировать нужный белок.

Начальный этап, выделение гена инсулина. В геноме человека этот ген прерывист: его кодирующие участки перемежаются с интронами, которые бактерии процессировать не умеют. Поэтому в качестве матрицы используют зрелую мРНК, считываемую с гена в клетках поджелудочной железы. С неё обратная транскриптаза (фермент, открытый у ретровирусов) синтезирует одноцепочечную ДНК, а затем достраивает вторую цепь. Полученную комплементарную ДНК, или кДНК, уже можно встраивать в вектор. Есть и альтернативный путь, химико-ферментативный синтез. Короткие олигонуклеотиды собирают на автоматическом синтезаторе, а потом сшивают в полный ген с помощью ДНК-лигазы. Такой подход позволяет сразу получить последовательность, оптимизированную под кодонный состав бактерий, что повышает эффективность трансляции.

Носителем гена служит плазмида, кольцевая молекула ДНК, способная автономно реплицироваться в бактериальной клетке. У природных плазмид забирают ориджин репликации и ген устойчивости к антибиотику (он позже пригодится для селекции). В эту основу встраивают полилинкер, участок с несколькими уникальными сайтами узнавания для рестриктаз. Рестриктазы, например EcoRI или BamHI, разрезают ДНК по строго определённым последовательностям, оставляя липкие концы. Те же ферменты обрабатывают плазмиду, получая комплементарные выступающие фрагменты. Если смешать вектор и вставку в присутствии ДНК-лигазы, происходит их ковалентное сшивание. Так формируется рекомбинантная плазмида.

Далее следует трансформация. Клетки Escherichia coli делают проницаемыми для ДНК, обрабатывая их хлоридом кальция и подвергая тепловому шоку. Лишь небольшая часть бактерий принимает плазмиду, поэтому выросшие на чашке с ампициллином колонии проверяют на наличие вставки. Классический метод, сине-белая селекция. Если ген инсулина встроился в полилинкер, он разрушает ген lacZ, и колония остаётся белой, а не окрашивается в синий цвет. Дополнительно проводят ПЦР-скрининг колоний или рестрикционный анализ выделенных плазмид, чтобы убедиться в правильной ориентации и целостности вставки.

Однако наличие гена в клетке ещё не гарантирует синтез белка. Для экспрессии конструкцию дополняют регуляторными элементами. Промотор (например, lac или T7) обеспечивает связывание РНК-полимеразы и запуск транскрипции. Сигнальная последовательность, кодирующая N-концевой пептид, направляет синтезируемый проинсулин в периплазматическое пространство или культуральную среду. Это важно: секреция упрощает выделение продукта и защищает его от деградации внутриклеточными протеазами. В ряде случаев ген инсулина соединяют с геном белка-носителя, такого как глутатион-S-трансфераза. Это стабилизирует продукт в цитоплазме и облегчает его очистку на аффинной колонке.

Сборка гена, вектора и регуляторных элементов в единую молекулу рекомбинантной ДНК, центральный узел всей технологии. От точности каждого этапа зависит, сможет ли клетка-хозяин произвести биологически активный инсулин в промышленном масштабе.

3. Экспрессия инсулина в бактериях и дрожжах

Когда рекомбинантная конструкция готова, наступает самый прагматичный этап: нужно заставить клетку-хозяина производить гормон в промышленных масштабах. Тут выбор обычно падает на два организма, и каждый диктует свою логику процесса.

Escherichia coli остается самым изученным и дешевым продуцентом. Но есть принципиальная сложность. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, A и B, которые соединены дисульфидными мостиками. Собирать целую молекулу внутри бактериальной клетки неэффективно, поэтому в случае с E. coli генетическую конструкцию создают так, чтобы клетка синтезировала A-цепь и B-цепь по отдельности. Их накапливают в виде телец включения, то есть плотных агрегатов белка в цитоплазме. После ферментации бактерии разрушают, тельца включения выделяют центрифугированием, а затем растворяют в хаотропном агенте, например в мочевине. Дальше цепи очищают, соединяют в пробирке и проводят рефолдинг: создают условия, в которых белок сам сворачивается в правильную пространственную структуру и образует нужные дисульфидные связи. Процесс трудоемкий, но отлаженный; именно так работают многие крупные производители.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae предлагают более элегантное решение. Они относятся к эукариотам, а значит, способны к посттрансляционным модификациям и корректному сворачиванию белков. Главное преимущество в том, что дрожжи секретируют продукт прямо в культуральную среду. Для этого в конструкцию включают сигнальную последовательность, которая направляет проинсулин (неактивного предшественника с дополнительной C-цепью) наружу клетки. Выход продукта во внешнюю среду радикально упрощает очистку: не нужно разрушать клетки и вытаскивать белок из общей массы бактериального мусора. Достаточно отделить дрожжи центрифугированием и работать с супернатантом. Затем проинсулин отщепляют от C-пептида ферментативным

способом, получая зрелый гормон.

В обоих случаях дальнейшая очистка идет по схожему сценарию. Ключевой метод здесь хроматография, обычно несколько последовательных стадий: ионообменная, гель-фильтрация и обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография. Каждый этап отсекает примеси и приближает препарат к требуемой степени чистоты, которая для фармакопейных стандартов должна превышать 99%.

Выход конечного продукта редко бывает стабильным с первого раза. Он зависит от трех переменных: состава питательной среды, параметров ферментации и самой генетической конструкции. Например, добавление в среду определенных аминокислот или оптимизация температуры и pH могут увеличить продуктивность в разы. В промышленности часто используют непрерывную ферментацию с подпиткой субстрата, чтобы поддерживать клетки в экспоненциальной фазе роста. Генетическая часть тоже не стоит на месте: подбирают сильные промоторы, оптимизируют кодонный состав гена под тРНК хозяина и копируют число плазмид. Варьируя эти параметры, удается достичь выхода, при котором производство становится рентабельным, а цена препарата доступной для пациентов.

4. Преимущества и перспективы биотехнологического инсулина

Переход от бактериальных и дрожжевых продуцентов к клиническому применению ознаменовал смену парадигмы в лечении диабета. Препараты из поджелудочных желез животных могли вызывать иммунный ответ из-за отличий в аминокислотной последовательности. Рекомбинантный человеческий инсулин, напротив, полностью идентичен эндогенному гормону. В этом структурном сходстве и кроется его главное терапевтическое преимущество: минимальная иммуногенность. Пациенты реже сталкиваются с образованием антител, липодистрофией в местах инъекций и аллергическими реакциями. Как следствие, повышается качество жизни и предсказуемость терапии.

Технология производства на базе микробных культур решила и проблему сырьевой базы. Потребность в инсулине исчисляется тоннами в год, и зависимость от сборов желез крупного рогатого скота стала бы непреодолимым ограничением. Биореакторы с контролируемой ферментацией позволяют масштабировать процесс без привязки к биологическому материалу животных. Это дает стабильность объемов и воспроизводимость качества. Каждая партия проходит строгий контроль по стандартам фармакопеи (например, по спецификации на генно-инженерный инсулин человека, где содержание примесей строго регламентировано).

Следующим шагом эволюции стали аналоги инсулина. Изменение аминокислотной последовательности позволило корректировать фармакокинетику, то есть скорость всасывания и продолжительность действия. Лизпро, аспарт и глулизин действуют быстрее человеческого гормона, эффективно купируя постпрандиальные пики глюкозы. Детемир и деглудек, напротив, обеспечивают стабильный базальный уровень на протяжении суток и более. Эти модификации, созданные методами генной инженерии, дали врачам инструменты для точной имитации физиологической секреции инсулина. При использовании нативного

гормона такая точность недостижима.

Перспективы развития лежат в плоскости совершенствования самих продуцентов и экспрессионных систем. Активно исследуются трансгенные растения, например, сафлор или табак, способные накапливать инсулин в семенах. Это сулит удешевление процесса за счет использования сельскохозяйственных мощностей. Параллельно ведутся работы по созданию трансгенных животных, продуцирующих человеческий инсулин в молоке, что упрощает выделение белка. Однако наибольший интерес вызывает редактирование генома. Технологии CRISPR/Cas9 открывают путь к тонкой настройке метаболических путей клеток-хозяев, повышению выхода целевого белка и подавлению синтеза нежелательных примесей. Оптимизация кодонов и создание синтетических промоторов позволяют увеличить продуктивность штаммов E. coli и S. cerevisiae на порядки. В итоге снижается себестоимость конечного препарата, и терапия становится доступнее для миллионов пациентов с сахарным диабетом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Синтез инсулина путем генной инженерии и применение ... — https://journals.csu.ru/index.php/vcsu_eh/article/view/1770

2. Генно-инженерные препараты инсулина человека — https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/1/1-7/1-7-1/genno-inzhenernye-preparaty-insulina-cheloveka/

3. ДОСТИЖЕНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В ЛЕЧЕНИИ ... — https://eduherald.ru/article/view?id=17882

4. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЙ ИНСУЛИН В РОССИИ — https://scienceforum.ru/2016/article/2016023406

5. ФС Инсулин растворимый человеческий генно-инженерный — https://static-0.minzdrav.gov.ru/system/attachments/attaches/000/044/084/original/%D0%A4%D0%A1_%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%83%D0%BB%D0%B8%D0%BD_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B2%D0%BE%D1%80%D0%B8%D0%BC%D1%8B%D0%B9__%D1%87%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%B2%D0%B5%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D0%BE-%D0%B8%D0%BD%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%80%D0%BD%D1%8B%D0%B9__08.04.19.docx?1554903254

6. Инсулин в борьбе с диабетом - GEA — https://www.gea.com/ru/customer-cases/insulin-in-the-diabetes-war/

7. Получение рекомбинантного инсулина — https://nsportal.ru/ap/library/drugoe/2021/05/25/poluchenie-rekombinantnogo-insulina

8. Способ получения генно-инженерного инсулина человека — https://patents.google.com/patent/RU2322504C1/ru