Роль грибов рода Penicillium в производстве антибиотиков

Содержание

1. 1. Открытие пенициллина и его значение3
2. 2. Механизм действия пенициллина на бактерии5
3. 3. Биосинтез пенициллина и его регуляция7
4. 4. Современные биотехнологии повышения продуктивности9
5. Список литературы11

1. Открытие пенициллина и его значение

В 1928 году Александр Флеминг работал в лондонской лаборатории больницы Святой Марии. Разбирая чашки Петри с колониями стафилококков, он заметил постороннее пятно. В одну из чашек случайно попала плесень, и вокруг неё бактерии погибли. Ученый выделил грибок, определил его как Penicillium notatum, а активное вещество назвал пенициллином. Но выделить соединение в чистом виде не удалось: оно оказалось крайне нестабильным. Публикация 1929 года прошла почти незамеченной. Сам Флеминг вскоре охладел к находке и занялся другими исследованиями. Прошло более десяти лет, прежде чем открытие получило вторую жизнь.

В 1938 году оксфордский патолог Говард Флори и биохимик Эрнст Чейн заинтересовались антибактериальными свойствами пенициллина. Чейн разработал метод лиофилизации, позволивший получить очищенный препарат, который сохранял активность. К 1941 году команда провела первые клинические испытания на людях. Первым пациентом стал полицейский Альберт Александер с тяжелейшим сепсисом, вызванным инфицированной раной. Лекарство подействовало поразительно: температура снизилась, состояние больного улучшилось. Однако запасов пенициллина не хватило, и после рецидива пациент умер. Несмотря на неудачу, эксперимент доказал потенциал препарата, и британское правительство выделило средства на массовое производство.

Ключевой проблемой оставалась продуктивность грибка. Penicillium notatum давал слишком мало вещества. Выход нашли американские микробиологи. В 1943 году на рынке Пеории (штат Иллинойс) обнаружили более производительный штамм Penicillium chrysogenum. Вместе с методом глубинной ферментации в больших резервуарах это позволило наладить промышленный выпуск. Уже к концу 1944 года пенициллин применяли для лечения раненых союзных войск в Европе. Результат оказался ошеломляющим. Смертность от бактериальных инфекций, таких как

гангрена и пневмония, снизилась в разы. До пенициллина пневмококковая пневмония убивала каждого третьего заболевшего, а при стафилококковом сепсисе выживали лишь единицы. С появлением антибиотика эти показатели изменились кардинально.

Значение открытия признали быстро. В 1945 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена сразу трем ученым: Флемингу, Чейну и Флори. В своей нобелевской лекции Флеминг предупреждал об опасности неконтролируемого применения пенициллина, отмечая, что бактерии могут выработать устойчивость. Его слова оказались пророческими, но в тот момент главным был триумф. Пенициллин стал первым антибиотиком, положившим начало целой эпохе в медицине. Открытие, сделанное случайно, но развитое упорным трудом нескольких научных коллективов, спасло миллионы жизней. Оно навсегда изменило подход к лечению инфекционных болезней.

2. Механизм действия пенициллина на бактерии

Пенициллин действует на бактерию не снаружи, а изнутри, вмешиваясь в процесс строительства её защитной оболочки. Бактериальная клетка окружена жёстким каркасом, который называется клеточной стенкой. Этот каркас придаёт форму и предохраняет бактерию от разрыва, поскольку внутриклеточное осмотическое давление заметно выше, чем в окружающей среде. Основу каркаса составляет пептидогликан, биополимер, образованный сахарными цепями, которые сшиты короткими пептидными мостиками.

Сборка пептидогликана проходит в несколько ферментативных этапов. На финальной стадии, когда сахарные цепи уже уложены, их поперечно сшивают пептидные связи. Эту операцию выполняют ферменты транспептидазы. Именно они создают прочную трёхмерную сетку, которая обеспечивает механическую прочность стенки. Молекула пенициллина по своей структуре напоминает фрагмент пептидной цепи, тот самый, что служит естественным субстратом для транспептидазы.

Встроенное в молекулу пенициллина бета-лактамное кольцо (четырёхчленный цикл) здесь играет решающую роль. Благодаря пространственному сходству фермент ошибочно связывает пенициллин вместо настоящего субстрата. Транспептидаза образует с антибиотиком ковалентную связь, и эта связь оказывается необратимой. Фермент блокируется навсегда и выключается из работы. Чем больше таких заблокированных ферментов, тем меньше поперечных связей появляется в пептидогликане. Сетка в итоге становится рыхлой и непрочной.

Клетка продолжает расти и увеличиваться, но её оболочка уже не в силах сдерживать внутреннее давление. В месте, где структура пептидогликана нарушена, стенка разрывается. Содержимое бактерии выходит наружу, и клетка погибает. Этот процесс разрушения клетки под действием собственного осмотического давления называют лизисом.

Поэтому пенициллин действует главным образом на растущие, делящиеся бактерии, которые активно синтезируют новые слои клеточной стенки. Покоящиеся клетки, которые пептидогликан не строят, к антибиотику менее чувствительны.

Селективная токсичность пенициллина, его ключевое преимущество как лекарства, объясняется просто. У животных клеток, включая клетки человека, клеточной стенки нет. Они окружены только тонкой цитоплазматической мембраной, в которой пептидогликан отсутствует. Значит, в клетках макроорганизма нет и ферментов транспептидаз, на которые направлен пенициллин. Антибиотику просто не с чем взаимодействовать, и токсического действия на организм пациента он не оказывает. Поражаются исключительно бактерии, для которых пептидогликан жизненно необходим.

3. Биосинтез пенициллина и его регуляция

Синтез пенициллина в клетке гриба начинается с трёх простых аминокислот, а не с готовых молекул. Это цистеин, валин и необычная для белков α-аминоадипиновая кислота. Они соединяются в строгой последовательности. Примечательно, что α-аминоадипиновая кислота играет роль якоря. Она не входит в конечную структуру антибиотика, но без неё правильная сборка молекулы невозможна.

Первый этап катализирует крупный мультиферментный комплекс δ-(L-α-аминоадипил)-L-цистеин-D-валинсинтетаза, сокращённо ACVS. Этот фермент весит около 420 кДа и работает как конвейер. Он последовательно активирует аминокислоты и сшивает их в трипептид. Сборка проходит в два подэтапа: сначала образуется дипептид, затем к нему присоединяется валин. В 1990-х годах группе исследователей под руководством Ахвердиана удалось очистить этот фермент из Penicillium chrysogenum. Тогда же подтвердили его доменную организацию, типичную для нетирибосомных пептидсинтетаз.

Дальше в дело вступает второй ключевой фермент, изопенициллин-N-синтаза, или IPNS. Эта окислительная酶 замыкает β-лактамное кольцо, превращая линейный трипептид в бициклическую структуру. Реакция требует кислорода и железа, а кофактором выступает α-кетоглутарат. Именно IPNS определяет стереохимию молекулы: образуется только природный изомер, активный против бактерий. Любые ошибки на этом этапе ведут к неактивным побочным продуктам.

Продуктивность гриба зависит от условий окружающей среды не меньше, чем от наличия ферментов. Классические исследования, проведённые ещё в 1950-х годах в Оксфорде, показали, что критически важен pH среды. При кислых значениях около 5,0 синтез идёт активно, а при сдвиге к нейтральным ферменты подавляются. Причина кроется в регуляции экспрессии генов: транскрипционные факторы,

чувствительные к pH, связываются с промоторами генов биосинтеза.

Источник углерода тоже влияет на выход антибиотика. Глюкоза, вопреки ожиданиям, подавляет биосинтез, поскольку запускает катаболитную репрессию. Гриб предпочитает более бедные субстраты: лактозу или сложные полисахариды. Аналогичная картина с азотом. Аммоний ингибирует синтез, а медленно усваиваемые аминокислоты, например глутамин, способствуют накоплению пенициллина. Эти наблюдения легли в основу промышленных сред, где используют кукурузный экстракт и лактозу.

Гены, кодирующие ферменты биосинтеза, у Penicillium chrysogenum расположены компактно на одной хромосоме. Кластер включает гены pcbAB (ACVS), pcbC (IPNS) и дополнительные гены модификации. Такая организация не случайна. Совместная экспрессия позволяет клетке быстро наращивать синтез при благоприятных условиях. Секвенирование генома, завершённое в 2008 году, показало, что кластер занимает около 60 тысяч пар оснований и содержит несколько регуляторных элементов. Координированная работа достигается за счёт общего транскрипционного фактора, который связывается с промоторами всех генов кластера одновременно.

Кластер расположен в теломерной области хромосомы, что делает его нестабильным при длительном культивировании. Штаммы, потерявшие часть кластера, резко снижают продуктивность. Этим объясняется, почему промышленные мутанты, полученные многократными раундами мутагенеза, часто содержат дупликации кластера. Например, штамм P2, используемый в производстве, несёт несколько копий генов ACVS и IPNS, что увеличивает выход антибиотика в разы.

4. Современные биотехнологии повышения продуктивности

Если классическая селекция позволяла лишь отбирать случайные мутации, то современная генная инженерия действует точечно. Промышленное производство пенициллина сегодня немыслимо без штаммов Penicillium chrysogenum, созданных с помощью направленных модификаций. Усиление экспрессии генов биосинтеза, в частности тех, что кодируют ферменты ACVS и IPNS, напрямую увеличивает выход целевого продукта. Дополнительные копии генов, встроенные в геном, позволяют грибу синтезировать больше ключевых ферментов, а значит, и больше антибиотика.

Редактирование генома методом CRISPR/Cas9 открыло возможности, о которых селекционеры середины XX века не могли и мечтать. Таргетное воздействие на конкретные участки ДНК позволяет не только усиливать продуктивные гены, но и отключать нежелательные метаболические пути, конкурирующие за предшественники. Отдельная задача, повышение устойчивости штаммов к стрессовым условиям, неизбежным в промышленных ферментерах. Высокая концентрация продукта токсична для самого гриба, и редактирование генов, отвечающих за стрессовые ответы, помогает культуре выживать и продолжать синтез.

Оптимизация ферментации остаётся ключевым фактором, и здесь биотехнология тесно переплетается с классической микробиологией. Состав питательной среды определяет всё: источник углерода, азота, концентрация микроэлементов. Например, избыток глюкозы подавляет биосинтез, поэтому часто используют более сложные субстраты, например, лактозу или медленно гидролизуемые полисахариды. Аэрация критична: Penicillium chrysogenum, аэроб, и дефицит кислорода резко снижает продуктивность. Температура и pH поддерживаются в строгих пределах, обычно около 25-27 °C и pH 6,5-7,0, хотя оптимальные значения могут варьироваться в зависимости от конкретного

штамма.

Традиционные периодические процессы ферментации имеют серьёзный недостаток: по мере накопления продукта условия в среде ухудшаются. Гриб стареет, метаболизм замедляется. Решение, непрерывные процессы, где свежая среда постоянно подаётся, а отработанная культуральная жидкость с пенициллином отводится. Это позволяет поддерживать культуру в экспоненциальной фазе роста и получать стабильный выход продукта в течение длительного времени. Снижаются затраты на простой оборудования между циклами, а общая производительность установки возрастает. По данным, приведённым в справочнике RLSnet, современные штаммы способны синтезировать в сотни раз больше пенициллина, чем исходный Penicillium notatum Флеминга, и во многом этот прогресс достигнут именно за счёт комбинации генетических и технологических решений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бензилпенициллин — https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B5%D0%BD%D0%B7%D0%B8%D0%BB%D0%BF%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%86%D0%B8%D0%BB%D0%BB%D0%B8%D0%BD

2. Пенициллины — https://www.rlsnet.ru/library/articles/akuserstvo-i-ginekologiya/penicilliny-14

3. Пенициллины — Википедия — https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%86%D0%B8%D0%BB%D0%BB%D0%B8%D0%BD%D1%8B

4. Пенициллины — https://chemical42.ru/tutorials/khimiya-prirodnykh-soedineniy/penitsilliny-khimiya-prirodnykh-soedineniy/

5. Пенициллины — https://www.rlsnet.ru/library/books/farmacevticeskii-enciklopediceskii-slovar-yua-kulikov-ai-slivkin-tg-afanaseva-pod-red-gl-vyskovskogo-yua-kulikova-m-vedanta-2015/5650-penicilliny

6. Группа пенициллинов — https://prah.antibiotic.ru/013-22.shtml

7. История открытия пенициллина. Досье — https://tass.ru/info/2659525

8. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МЕТАБОЛИЧЕСКОМ ПУТИ БИОСИНТЕЗА ПЕНИЦИЛЛИНА И ЦЕФАЛОСПОРИНА — https://kodomo.fbb.msu.ru/~annakamysheva/KEGG.html